脑组织免疫组化

脑组织免疫组化详细步骤（含对各实验步骤的心得体会），我硕士时做的实验记录，传上来与大家交流一下哦
1 脑组织标本适当厚度，置于AF液中浸泡（后固定），可较长时间，可过夜，甚至有的泡几天都可以。
2 取标本，70%酒精3小时，95%酒精3小时，然后95%酒精过夜。
3 100%酒精脱水两次，每次1.5小时，或者1小时，2小时。
4 松节油透明两次，20分钟-40分钟，（也可用二甲苯透明，但是性质较猛，透明力度不好掌握）
5 浸蜡3小时，包埋修块（包埋动作要快，否则蜡稍凝固后在放标本的话作出的片子周围气泡较多）
6 切片，切片刀相当重要，在前面较大切片厚度修块的时候可以用旧刀，但是正式用5um切时，必须用好刀或是新刀，这样切出的片子质量高，在以后的冲洗中也不容易掉，脑组织保存良好。展片时水温不宜过高，同时注意展片手法，一个片子上1-2层组织就可以了，不要贪多，最后反影响片子质量。
7 烤箱过夜（温度稍高于蜡的熔点几度即可，不可太高，一般五十八九度到六十一二度）
8 二甲苯脱蜡三次，15分钟*3
9 100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精各15分钟*4
10 自来水冲洗4-10分钟，我们一般5分钟
11 3%-10%双氧水室温15分钟（我们自己采用的是薛老师教的办法：100ml甲醇+2ml双氧水浸泡起码30分钟，泡的过程中可以用另外一个空倒缸或叫睡缸倒一倒，这样接触更充分，注意原液双氧水对皮肤有强刺激性，取的时候注意别沾皮肤，深有体会！）
12 PBS冲洗，2分钟*2
13 微波抗原修复，不管用什么方法使抗原修复液温度达92-98度30分钟（我们用抗原修复盒盛修复液，先2分钟-2。5分钟然后50秒-10秒周期性加热）
14 室温放凉也可在带冰的水浴中放凉，但我不是很赞成后者（仅个人意见）
15 PBS冲洗两次，5分钟*2或者3分钟*3
16 正常羊血清封盖标本室温30分钟孵育（在保湿盒里）
17 甩去血清，勿洗！！！！
18 PBS稀释的一抗滴加覆盖到整个标本，预实验时探索一抗浓度相当重要，这是决定染色成败的关键步骤之一，要想阳性细胞与背景对比明显则使用较低浓度孵育较长时间，一般是4℃过夜或是37℃2小时。但是推荐前者。加之前用洗耳球将标本上的水吹干净。加之前还可用蜡将标本圈上，这样较容易加样，而且不浪费抗体
19 PBS冲洗三次，3分钟*3
20 加二抗（有的是工作液不用稀释）室温孵育20分钟（加之前吹干净标本上的水），PBS冲洗三次，3分钟*3
21 加三抗室温孵育15分钟，PBS冲洗三次，3分钟*3
22 DAB显色，根据显微镜下的观察决定终止显色的时间
23 如果不需要复染则直接封片
复染（根据需要进行）
1 苏木精1-3分钟（也可根据苏木精的配制时间灵活掌握这一步时间，有时可以短到十几秒时间）
2 自来水冲洗2分钟
3 1%盐酸分化1-4秒
4 自来水冲洗2分钟
5 2%氨水反蓝数秒（使核更蓝）
6 自来水冲洗2分钟
7 70%酒精80%酒精90%酒精各5分钟*3。100%酒精100%酒精各10分钟*2。以上各个酒精也可简化为每个一分钟，好象片子质量也不受影响
8 风干后，树胶封片晾干。（因为我们的树胶里面已经加了二甲苯，所以这一个步骤之前不用二甲苯处理，否则这个步骤之前须用二甲苯处理）