综述论文写作格式

一. 题目 题目是文章最重要和最先看到的部分 应能吸引读者 并给人以最简明的提示。
　　1.应尽量做到简洁明了并紧扣文章的主题，要突出论文中特别有独创性、有特色的内容，使之起到画龙点睛 启迪读者兴趣的作用。
　　2.字数不应太多 一般不宜超过20个字。
　　3.应尽量避免使用化学结构式、数学公式或不太为同行所熟悉的符号、简称、缩写以及商品名称等。题目中尽量不要用标点符号。
　　4.必要时可用副标题来做补充说明，副标题应在正题下加括号或破折号另行书写。
　　5.若文章属于“资助课题”项目 可在题目的右上角加注释角号（如 ※、＃等） 并在脚注处（该文左下角以横线分隔开）书写此角号及其加注内容。
　　6.为了便于对外交流 应附有英文题名 所有字母均用大写，放在中文摘要与关键词的下面。
　　二. 作者 署名是论文的必要组成部分 要能反映实际情况。
　　1.作者应是论文的撰写者 是指直接参与了全部或部分主要工作 对该项研究作出实质性贡献 并能对论文的内容和学术问题负责者。
　　2.研究工作主要由个别人设计完成的 署以个别人的姓名; 合写论文的署名应按论文工作贡献的多少顺序排列; 学生的毕业论文应注明指导老师的姓名和职称。作者的姓名应给出全名。
　　3.作者的下一行要写明所在的工作单位（应写全称），并注上邮政编码。
　　4.为了便于了解与交流 论文的最后应附有通迅作者的详细通讯地址、电话、传真以及电子信箱地址。
　　三. 摘要 摘要是科研论文主要内容的简短、扼要而连贯的重述，必须将论文本身新的、最具特色的内容表达出来（重点是结果和结论）。
　　1.具体写法有“结构式摘要” 和“非结构式摘要”两种，前者一般分成目的、方法、结果和结论四个栏目，规定250字左右；后者不分栏目 规定不超过150个字，目前国内大多数的医学、药学期刊都采用“结构式摘要”。
　　2.摘要具有独立性和完整性，结果要求列出主要数据及统计学显著性。
　　3.一般以第三人称的语气写，避免用“本文”、“我们”、“本研究”等作为文摘的开头。
　　四.关键词 关键词也叫索引词 主要为了图书情报工作者编写索引 也为了读者通过关键词查阅需要的论文。
　　1.关键词是从论文中选出来用以表示全文主题内容的单词或术语，要求尽量使用《医学主题词表》(MeSH) 中所列的规范性词(称叙词或主题词)。
　　2.关键词一般选取3～8个词 并标注与中文一一相对应的英文关键词。每个词之间应留有空格以区别之。
　　3.关键词通常位于摘要之后，引言之前。
　　五．引言 引言(导言、序言)作为论文的开端 起纲领的作用，主要回答“为什么研究”这个课题。
　　1.引言的内容主要介绍论文的研究背景、目的、范围 简要说明研究课题的意义以及前人的主张和学术观点 已经取得的成果以及作者的意图与分析依据包括论文拟解决的问题、研究范围和技术方案等。
　　2.引言应言简意赅 不要等同于文摘或成为文摘的注释。如果在正文中采用比较专业化的术语或缩写词时 最好先在引言中定义说明。
　　3.字数一般在300字以内。
　　六. 正文 正文是科研论文的主体 包括材料、方法、结果、讨论四部分内容 其中某些部分（特别是方法和结果）还需列出小标题 以使层次更加清晰。
　　1.材料 材料是科学研究的物质基础 需要详细说明研究的对象、药品试剂、仪器设备等。
　　（1）如属动物实验研究 材料中需说明实验动物的名称、种类、品系、分级、数量、性别、年(月)龄、体重、健康状态、分组方法、每组的例数等；如属用药的临床观察 应说明观察对象的例数、性别、年龄、职业、病例种类、症状体征、诊断标准、分组方法、治疗措施、临床观察指标及疗效判定标准（如痊愈、显效、好转、无效的标准）等。
　　（2）说明受试药的来源、批号、配制方法等，中药应注明学名、来源，粗提物应标明有效部位或成分的含量和初步的质量标准，若是作者本实验室自行提取的应简述提取过程。
　　（3）标明主要仪器设备的生产单位、名称、型号、主要参数与精密度等。
　　（4）标明主要药品、试剂的名称（尽量用国际通用的化学名 不用商品名）、成分、批号、纯度、用量、生产单位、出厂日期及配制方法等。
　　2．方法
　　（1）采用已有报道的方法只要注明文献的出处即可，不必详述其过程；若为有创意的方法 要详细介绍创新之处，便于读者依此重复验证；若是对常规方法作出改进的 应具体描述改进部分及改进的理由 同时也要注明原法的文献出处。
　　（2）对于实验条件可变因素的控制方法（如放射免疫法的质量控制）要加以详细说明 以显示本文结果的可靠性和准确性。
　　（3）实验研究论文要设立阴性对照组和阳性药物对照组，前者一般采用溶剂作为对照，后者选用被公认的、确有疗效的药物，以验证实验方法的可靠性。
　　（4）在进行药效学和毒理学研究时，通常要设高、中、低三个剂量组，以体现出药物的量－效关系。
　　（5）实验设计时应考虑到每组有足够的样本数以满足统计学处理的需要，一般地说，小动物（如大、小鼠）每组至少8～10只，大动物（如狗）每组至少4～6只。同时应说明数据处理的统计学方法，统计学处理结果一般用P>0.05、P<0.05、P<0.01三档表示。
　　3.结果 试验结果是论文的核心部分 这一部分要求将研究中所得到的各种数据进行分析、归纳 并将经统计学处理后的结果用文字或图表的形式予以表达。
　　（1）表格
　　 ①表格设计要清晰、简练、规范。每个表格除有栏头、表身外，还要有表序（如表1、表2、表3……）和表题 表题与表序居中写 中间空一格将两者分开。在正文中要明确提及见表×。②表随文放 一般应列在“见表×”文字的自然段落的下面。
　　③表格一般采用三线表。
　　④表题应有自明性。若表中数据均用“均数±标准差”表示，则在表题的后面注上( ±S)；若表中各组的例数相等，则在表题后面统一注上(n=X)，若例数不等应另加一列，分别注上各组的例数；表中计量单位若一致 可写在表题的后面若不一致应分别写在每个栏头之下 不加括号。
　　⑤表内阿拉伯数字上下各行的个位数对齐 未发现的数据用“-”表示 未测或无此项用空白表示 实测结果为零用“0”表示。
　　（2）插图
　　①图包括示意图、曲线图、照片图等。
　　②图要求大小比例适中 粗细均匀 数字清晰 照片黑白对比分明。与表一样图也要随文字放 先见文字 后见图。
　　③每幅图都要有图序和图题 通常写在图的下方。图题要有自明性。
　　（3）结果处理时要尊重事实 要求结果中的数据精确完整、可靠无误，同时要注意不应忽视偶然发生的现象和数据。
　　（4）药物的临床疗效研究结果，要注意交待与药物有关的全部信息 如疗效、毒副作用及注意事项等。
　　4．讨论 讨论是结果的逻辑延伸，是全文的综合、判断、推理 从感性提升到理性认识的过程 也是作者充分运用自已对该领域所掌握的知识 联系本课题的实践 提出新见解、阐明新观点之处。
　　（1）讨论应从结果出发 紧扣题目 不宜离题发挥。具体地说应对本实验所观察到的结果 分析其理论和实践意义 能否证实有关假说的正确性 找出结果中的内在规律 与自己过去的或其他作者的结果及其理论解释进行比较 分析异同及其可能原因 根据自己的或参考别人的材料提出新见解。
　　（2）讨论中应该运用一分为二的观点，正确地分析和评价自己工作中可能存在的不足之处和教训 例如本研究所用方法是否有局限性等; 提出今后研究方向及本结果可能的推广应用的设想 这往往对读者的思路有所启发。
　　（3）篇幅较长的讨论 应分项目编写 每个项目应集中论述一个中心内容并冠以序码。讨论的中心内容应与正文各部分 特别是结果部分相呼应。讨论中不应过细重复以上各部分的数据。
　　（4）为体现讨论的客观性 写作时一般采用第三人称语气。
　　（5）讨论切忌写成文献综述，更不应简单地重复实验结果，而是从理论上有选择地对研究结果进行分析、比较、解释、推理 对主要问题 特别是本研究创新、独到之处加以充分发挥，提出新的假说 揭示有待进一步研究的问题及今后的研究方向。
　　七.致谢 凡不具备前述作者资格 但对本研究作过指导、帮助的人或机构均应加以感谢，但必须得到被致谢人的同意后才能署其姓名。致谢一般单独成段放在正文的后面。
　　八．参考文献 参考文献要求引用作者亲自阅读过的、最主要的文献 包括公开发表的出版物、专利及其他有关档案资料 内部讲义及未发表的著作不宜作为参考文献著录。
　　1.论文所列参考文献一般不超过10条 综述不超过30条。
　　2.文内标注法: 著录时按文中引用文献出现的先后顺序用阿拉伯数字连续编号 直接引用作者全文的 文献序号置于作者姓氏右上角方括号内。
　　3.文献序号作正文叙述的直接补语时 应与正文同号的数字并排 不用上角码标注。如: 实验方法见文献〔2〕或据文献〔2〕报道。
　　4.著录格式
　　（1）杂志: 序号(顶格). 作者 文章名，刊物名 年、卷（期）、起始页码。如：刘康 季晖 李绍平等. 三种大鼠骨质疏松模型的比较. 中国骨质疏松杂志 1998 4(4):13～18
　　（2）书: 序号(顶格)　著者，书名，版次，出版地，出版者 出版年，起讫页码。如：徐叔云，卞如濂，陈修主编. 药理实验方法学 第三版 北京 人民卫生出版社 2002: 911～916
　　5.著录规则
　　（1）作者: 3名或少于3名者全部写出 并用逗号分隔 3名以上写前3人的姓名 后加“等”或“etal”。集体作者要写全称。
　　（2）刊名: 中文均写全称 外文缩写可按美国医学索引《InderMedicus》的格式。
　　（3）版次(本): 第一版不标注 其它版次用阿拉伯数著录。如“第2版”“2nd”。

医学综述写作要点

综述的格式和写法
　　综述一般都包括题名、著者、摘要、关键词、正文、参考文献几部分。其中正文部分又由前言、主前言 用200～300字的篇幅，提出问题，包括写作目的、意义和作用，综述问题的历史、资料来源、现状和发展动态，有关概念和定义，选择这一专题的目的和动机、应用价值和实践意义，如果属于争论性课题，要指明争论的焦点所在。
　　主体主要包括论据和论证。通过提出问题、分析问题和解决问题，比较各种观点的异同点及其理论根据，从而反映作者的见解。为把问题说得明白透彻，可分为若干个小标题分述。这部分应包括历史发展、现状分析和趋向预测几个方面的内容。①历史发展：要按时间顺序，简要说明这一课题的提出及各历史阶段的发展状况，体现各阶段的研究水平。②现状分析：介绍国内外对本课题的研究现状及各派观点，包括作者本人的观点。将归纳、整理的科学事实和资料进行排列和必要的分析。对有创造性和发展前途的理论或假说要详细介绍，并引出论据；对有争论的问题要介绍各家观点或学说，进行比较，指问题的焦点和可能的发展趋势，并提出自己的看法。对陈旧的、过时的或已被否定的观点可从简。对一般读者熟知的问题只要提及即可。②趋向预测：在纵横对比中肯定所综述课题的研究水平、存在问题和不同观点，提出展望性意见。这部分内容要写得客观、准确，不但要指明方向，而且要提示捷径，为有志于攀登新高峰者指明方向，搭梯铺路。主体部分没有固定的格式，有的按问题发展历史依年代顺序介绍，也有按问题的现状加以阐述的。不论采用哪种方式，都应比较各家学说及论据，阐明有关问题的历史背景、现状和发展方向。主体部分的写法有下列几种：
　　（1） 纵式写法 “纵”是“历史发展纵观”。它主要围绕某一专题，按时间先后顺序或专题本身发展层次，对其历史演变、目前状况、趋向预测作纵向描述，从而勾划出某一专题的来龙去脉和发展轨迹。纵式写法要把握脉络分明，即对某一专题在各个阶段的发展动态作扼要描述，已经解决了哪些问题，取得了什么成果，还存在哪些问题，今后发展趋向如何，对这些内容要把发展层次交代清楚，文字描述要紧密衔接。撰写综述不要孤立地按时间顺序罗列事实，把它写成了“大事记”或“编年体”。纵式写法还要突出一个“创”字。有些专题时间跨度大，科研成果多，在描述时就要抓住具有创造性、突破性的成果作详细介绍，而对一般性、重复性的资料就从简从略。这样既突出了重点，又做到了详略得当。纵式写法适合于动态性综述。这种综述描述专题的发展动向明显，层次清楚。
　　（2） 横式写法 “横”是“国际国内横览”。它就是对某一专题在国际和国内的各个方面，如各派观点、各家之言、各种方法、各自成就等加以描述和比较。通过横向对比，既可以分辨出各种观点、见解、方法、成果的优劣利弊，又可以看出国际水平、国内水平和本单位水平，从而找到了差距。横式写法适用于成就性综述。这种综述专门介绍某个方面或某个项目的新成就，如新理论、新观点、新发明、新方法、新技术、新进展等等。因为是“新”，所以时间跨度短，但却引起国际、国内同行关注，纷纷从事这方面研究，发表了许多论文，如能及时加以整理，写成综述向同行报道，就能起到借鉴、启示和指导的作用。
　　（3）纵横结合式写法在同一篇综述中，同时采用纵式与横式写法。例如，写历史背景采用纵式写法，写目前状况采用横式写法。通过“纵”、“横”描述，才能广泛地综合文献资料，全面系统地认识某一专题及其发展方向，作出比较可靠的趋向预测，为新的研究工作选择突破口或提供参考依据。无论是纵式、横式或是纵横结合式写法，都要求做到：一要全面系统地搜集资料，客观公正地如实反映；二要分析透彻，综合恰当；三要层次分总结，主要是对主题部分所阐述的主要内容进行概括，重点评议，提出结论，最好是提出自己的见解，并提出赞成什么，反对什么。
　　参考文献写综述应有足够的参考文献，这是撰写综述的基础。它除了表示尊重被引证者的劳动及表明文章引用资料的根据外，更重要的是使读者在深入探讨某些问题时，提供查找有关文献的线索。综述性论文是通过对各种观点的比较说明问题的，读者如有兴趣深入研究，可按参考文献查阅原文。因此，必须严肃对待。
　　2、综述的写作步骤
　　选定题目选定题目对综述的写作有着举足轻重的作用。选题首先要求内容新颖，只有新颖的内容才能提炼出有磁石般吸引力的题目。选题还应选择近年来确有进展，适合我国国情，又为本专业科技人员所关注的课题，如对国外某一新技术的综合评价，以探讨在我国的实用性；又如综述某一方法的形成和应用，以供普及和推广。选题通常有几种：一种是与作者所从事的专业密切相关的选题，对此作者有实际工作经验，有比较充分的发言权；一种是选题与作者专业关系不大，而作者掌握了一定的素材，又乐于探索的课题；还有一种是医学科学情报工作者的研究成果。
题目不要过大，过大的题目一定要有诸多的内容来充实，过多的内容必然要查找大量的文献，这不但增加阅读、整理过程的困难，或者无从下手，或顾此失彼；而且面面俱到的文稿也难以深入，往往流于空泛及一般化。实践证明，题目较小的综述穿透力强，易深入，特别对初学写综述者来说更以写较小题目为宜，从小范围写起，积累经验后再逐渐写较大范围的专题。此外，题目还必须与内容相称、贴切，不能小题大作或大题小作，更不能文不对题。好的题目可一目了然，看题目可知内容梗概。
　　查阅文献题目确定后，需要查阅和积累有关文献资料。对初学者来说，查找文献往往不知从哪里下手，一般可首先搜集有权威性的参考书，如专著、教科书、学术论文集等，教科书叙述比较全面，提出的观点为多数人所公认；专著集中讨论某一专题的发展现状、有关问题及展望；学术论文集能反映一定时期的进展和成就，帮助作者把握住当代该领域的研究动向。其次是查找期刊及文献资料，期刊文献浩如烟海，且又分散，但里面常有重要的近期进展性资料，吸收过来，可使综述更有先进性，更具有指导意义。查找文献资料的方法有两种。一种是根据自己所选定的题目，查找内容较完善的近期（或由近到远）期刊，再按照文献后面的参考文献，去收集原始资料。这样“滚雪球”式的查找文献法就可收集到自己所需要的大量文献。这是比较简便易行的查阅文献法，许多初学综述写作者都是这样开始的。另一种较为省时省力的科学方法，是通过检索工具书查阅文献。常用的检索工具书有文摘和索引类期刊，它是查阅国内外文献的金钥匙，掌握这把金钥匙，就能较快地找到需要的文献。此外，在平时工作学习中，随时积累，做好读书文摘或笔记，以备用时查找，可起到拾遗补缺作用。
　　查找到的文献首先要浏览一下，然后再分类阅读。有时也可边搜集、边阅读，根据阅读中发现的线索再跟踪搜集、阅读。资料应通读、细读、精读，这是撰写综述的重要步骤，也是咀嚼和消化、吸收的过程。阅读中要分析文章的主要依据，领会文章的主要论点，用卡片分类摘记每篇文章的主要内容，包括技术方法、重要数据、主要结果和讨论要点，以便为写作做好准备。
　　加工处理对阅读过的资料必须进行加工处理，这是写综述的必要准备过程。按照综述的主题要求，把写下的文摘卡片或笔记进行整理，分类编排 ，使之系列化、条理化，力争做到论点鲜明而又有确切依据，阐述层次清晰而合乎逻辑。按分类整理好的资料轮廓，再进行科学的分析。最后结合自己的实践经验，写出自己的观点与体会，这样客观资料中就融进了主观资料。
　　撰写成文 撰写成文前应先拟提纲，决定先写什么，后写什么，哪些应重点阐明，哪些地方融进自己的观点，哪些地方可以省略或几笔带过。重点阐述处应适当分几个小标题。拟写题纲时开始可详细一点，然后边推敲边修改。多一遍思考，就会多一分收获。
　　提纲拟好后，就可动笔成文。按初步形成的文章框架，逐个问题展开阐述，写作中要注意说理透彻，既有论点又有论据，下笔一定要掌握重点，并注意反映作者的观点和倾向性，但对相反观点也应简要列出。对于某些推理或假说，要考虑到医学界专家所能接受的程度，可提出自己的看法，或作为问题提出来讨论，然后阐述存在问题和展望。初稿形成后，按常规修稿方法，反复修改加工。
　　撰写综述要深刻理解参考文献的内涵，做到论必有据，忠于原著，让事实说话，同时要具有自己的见解。文献资料是综述的基础，查阅文献是撰写综述的关键一步，搜集文献应注意时间性，必须是近一二年的新内容，四五年前的资料一般不应过多列入。综述内容切忌面面俱到，成为浏览式的综述。综述的内容越集中、越明确、越具体越好。参考文献必须是直接阅读过的原文，不能根据某些文章摘要而引用，更不能间接引用（指阅读一篇文章中所引用的文献，并未查到原文就照搬照抄），以免对文献理解不透或曲解，造成观点、方法上的失误。

Triton-100配制

T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。

30% Triton X-100的配制：

试剂：Triton X-100 28.2ml

0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml

配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。

Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等

脑组织免疫组化

脑组织免疫组化详细步骤（含对各实验步骤的心得体会），我硕士时做的实验记录，传上来与大家交流一下哦
1 脑组织标本适当厚度，置于AF液中浸泡（后固定），可较长时间，可过夜，甚至有的泡几天都可以。
2 取标本，70%酒精3小时，95%酒精3小时，然后95%酒精过夜。
3 100%酒精脱水两次，每次1.5小时，或者1小时，2小时。
4 松节油透明两次，20分钟-40分钟，（也可用二甲苯透明，但是性质较猛，透明力度不好掌握）
5 浸蜡3小时，包埋修块（包埋动作要快，否则蜡稍凝固后在放标本的话作出的片子周围气泡较多）
6 切片，切片刀相当重要，在前面较大切片厚度修块的时候可以用旧刀，但是正式用5um切时，必须用好刀或是新刀，这样切出的片子质量高，在以后的冲洗中也不容易掉，脑组织保存良好。展片时水温不宜过高，同时注意展片手法，一个片子上1-2层组织就可以了，不要贪多，最后反影响片子质量。
7 烤箱过夜（温度稍高于蜡的熔点几度即可，不可太高，一般五十八九度到六十一二度）
8 二甲苯脱蜡三次，15分钟*3
9 100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精各15分钟*4
10 自来水冲洗4-10分钟，我们一般5分钟
11 3%-10%双氧水室温15分钟（我们自己采用的是薛老师教的办法：100ml甲醇+2ml双氧水浸泡起码30分钟，泡的过程中可以用另外一个空倒缸或叫睡缸倒一倒，这样接触更充分，注意原液双氧水对皮肤有强刺激性，取的时候注意别沾皮肤，深有体会！）
12 PBS冲洗，2分钟*2
13 微波抗原修复，不管用什么方法使抗原修复液温度达92-98度30分钟（我们用抗原修复盒盛修复液，先2分钟-2。5分钟然后50秒-10秒周期性加热）
14 室温放凉也可在带冰的水浴中放凉，但我不是很赞成后者（仅个人意见）
15 PBS冲洗两次，5分钟*2或者3分钟*3
16 正常羊血清封盖标本室温30分钟孵育（在保湿盒里）
17 甩去血清，勿洗！！！！
18 PBS稀释的一抗滴加覆盖到整个标本，预实验时探索一抗浓度相当重要，这是决定染色成败的关键步骤之一，要想阳性细胞与背景对比明显则使用较低浓度孵育较长时间，一般是4℃过夜或是37℃2小时。但是推荐前者。加之前用洗耳球将标本上的水吹干净。加之前还可用蜡将标本圈上，这样较容易加样，而且不浪费抗体
19 PBS冲洗三次，3分钟*3
20 加二抗（有的是工作液不用稀释）室温孵育20分钟（加之前吹干净标本上的水），PBS冲洗三次，3分钟*3
21 加三抗室温孵育15分钟，PBS冲洗三次，3分钟*3
22 DAB显色，根据显微镜下的观察决定终止显色的时间
23 如果不需要复染则直接封片
复染（根据需要进行）
1 苏木精1-3分钟（也可根据苏木精的配制时间灵活掌握这一步时间，有时可以短到十几秒时间）
2 自来水冲洗2分钟
3 1%盐酸分化1-4秒
4 自来水冲洗2分钟
5 2%氨水反蓝数秒（使核更蓝）
6 自来水冲洗2分钟
7 70%酒精80%酒精90%酒精各5分钟*3。100%酒精100%酒精各10分钟*2。以上各个酒精也可简化为每个一分钟，好象片子质量也不受影响
8 风干后，树胶封片晾干。（因为我们的树胶里面已经加了二甲苯，所以这一个步骤之前不用二甲苯处理，否则这个步骤之前须用二甲苯处理）

免疫组化方法中关键环节及其原理解述

一、酶免疫组化的关键环节

1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。

2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。

5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。

7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9、抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。

10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

12、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。

盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

二、免疫荧光方法中的重要环节

1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。

4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。

7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果

免疫组化概念

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。